Oczar Wirginijski - Raport medyczny

Uniwersytet Medyczny w Łodzi Wydział Farmaceutyczny
ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ
Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej
90-235 Łódź, ul. Pomorska 137,
tel/fax. (0 42) 677-93-00 tel. (0 42) 677-93-01
e-mail: zmf@pharm.am.lodz.pl

TABELE:

RAPORT:

Oznaczenie działania przeciwdrobnoustrojowego preparatu "Witch Hazel"
zawierającego wyciąg z oczaru wirginijskiego (Hamamelis Virginiana L.)

Prof. dr hab. Eligia M. Szewczyk
Dr Matgorzata Rozalska
Mgr Tomasz Nowak

Przedmiot badania

Przedmiotem badania był preparat "Witch Hazel" Astringent, U.S.P. seria 394629; dystrybutor HUMCO, Texarkana, Texas 75501 USA dostarczony przez polskiego importera firmę "Septyk" w Łodzi. Badany preparat jest bezbarwną cieczą otrzymywaną przez podwójną destylację wodnego wyciągu z gałązek oczaru wirginijskiego (Hamamelis Virginiana] zawierający 14% alkoholu elylowego otrzymanego ze zboża.

Wróć do początku

Szczepy bakteryjne

Badania przeprowadzono na grupie dziewięciu szczepów drobnoustrojów. Pięc stanowiło szczepy wzorcowe zalecane przez Państwowy Instytut Leków do badania skuteczności działania środków odkażających i dezynfekcyjnych. Ponadto użyto czterech szczepów klinicznych szeroko opornych na antybiotyki. Do badań wykorzystano cztery szczepy ziarenkowców Gram-dodatnich: dwa pochodziły z amerykańskiej kolekcji drobnoustrojów (ATCC) gronkowce złociste (Staphylococcus aureus 6538) i paciorkowce kalowe (Enterococcus hirae 10541), a dwa wyizolowane zostały z materiału klinicznego metycylinooporny gronkowiec złocisty (MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus aweus] i paciorkowiec kalowy (Enterococcus faecalis) charakteryzujący się wysoką opornoscią na antybiotyki aminoglikozydowe (HLAR+). Bakterie Gram-ujemne reprezentowane były przez cztery szczepy pałeczek. Dwa wzorcowe z kolekcji ATCC - pałeczki okrężnicy (Escherichia coli 10532) i pałeczki ropy blękitnej (Pseudomonas aeruguwsa 15442), a dwa z przypadków klinicznych - pałeczka oskrzelowa (Klebsiella oxytoca) i paleczka okrężnicy (Escherichia coli). Były to wielooporne (ESBL-dodatnie) izolaty szpitalne. Aktywność preparatu w stosunku do grzybów drożdżopodobnych badań wykorzystując wzorcowy szczep Candida albicans ATCC 10231.

Wróć do początku

Oznaczenie najmniejszego stężenia hamującego (MIC) metodą makrorozcieńczeń w podłożu płynnym [4]

Przygotowanie i standaryzacja zawiesin drobnoustrojów:

Badane drobnoustroje, pobrane z 24-godzinnej hodowli na podłożu krwawym przesiewano na bulion Mueller Hintona 2 (MH). Inkubację prowadzono ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C przez 4-5 godzin. Zawiesinę o zmętnieniu równym 0,5 w skali McFarlanda sporządzano przez zawieszenie płynnej hodowli w jałowym, fizjologicznym roztworze NaCl. Pomiar zmętnienia mierzono przy użyciu nefelometru (Becton Dickinson). Tak przy gotowaną zawiesinę rozcienczano 10-krotnie w bulionie MH.

Wykonanie oznaczenia:

Do przygotowania szeregu rozcieńczeń badanego preparatu stosowano 5-krotnie zagęszczony bulion MH. Dla każdego drobnoustroju przygotowano szereg zawierający od 80% do 35% wyciągu, zmniejszając stężenie, co 5%. Ostatnia probówka w szeregu nie zawierała preparatu i stanowita kontrolę wzrostu użytego do badan szczepu. Podłoża zakazano przez dodanie 50 µL wystandaryzowanej zawiesiny drobnoustroju. Inkubację prowadzono w warunkach stacjonarnych w temperaturze 37°C przez 20 godzin, a dla Candida albicans w 30°C przez 48 godzin. Po tym czasie obserwowano wzrost drobnoustrojów lub jego zahamowanie. Za MIC przyjmowano najnizsze stężenie, przy którym obserwowano całkowity brak wzrostu badanego szczepu.

Wróć do początku

Oznaczenie najmniejszego stężenia bójczego (MBC)

Oznaczanie wyjściowej liczby drobnoustrojów metodą posiewu powierzchniowego:

Z probówki kontrolnej, natychmiast po posianiu, pobierano 10µL bulionu i rozcieńczano w 10 ml jałowego, fizjologicznego roztworu NaCl, a następnie lOOµL próbki posiewano na plytkę krwawą. Zawiesinę rozprowadzano równomiernie po powierzchni podłoża szklaną glaszczką i po 20 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C liczono wyrosłe kolonie. Uwzględniając rozcieńczenie wynik - liczby jednostek tworzących kolonie (CPU) -przeliczano na 1 ml.

Wykonanie oznaczenia:

Z probówek, w których stwierdzono zahamowanie wzrostu drobnoustroju pobierano lOµL hodowli i rozprowadzano po powierzchni płytki krwawej. Po inkubacji w warunkach opisanych powyżej zliczano wyrosłe kolonie, przeliczano na 1ml hodowli i obliczano odsetek przeżywających komórek.

Wróć do początku

Wyniki

Preparat "Witch Hazel" hamował wzrost wszystkich użytych w badaniach szczepów drobnoustrojów. Wyniki określenia najmniejszego stężenia hamującego wzrost drobnoustrojów (MIC) w przedziale próbek zawierających 80-35% badanego preparatu w próbie zestawiono w Tabeli 1. Wrażliwość poszczególnych szczepów była zróżnicowana. Najsilniej hamowany był wzrost dwóch szczepów wzorcowych: grzybów z rodzaju Candida i pałeczek ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa). Skuteczność działania w stosunku do nich wykazywał preparat ,,Witch Hazel" użyty w stężeniu 40%. Pozostałe szczepy należące do grupy pałeczek Gram-ujemnych także wykazywały wrażliwość. W nieznacznie tylko wyższym stężeniu 45% preparatu nie wyrastał kliniczny szczep pałeczki oskrzelowej (Klebsiella oxytoca). Szczepy pałeczek okrężnicy (Escherichia coli), zarówno wzorcowy jak i kliniczny, hamowane były przez %. nieco wyższe stężenia wyciągu oczarowego, odpowiednio 55% i 60%.

Aktywność przeciwbakteryjna preparatu w stosunku do ziarenkowców Gram-dodatnich była nieco słabsza, z wyjątkiem paciorkowców kałowych (Enterococcus faecalis), których wzrost był hamowany na pożywce przy stężeniu preparatu 50%. Wzrost wzorcowego szczepu gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus] hamowany był przy stężeniu 65%. Inhibicję wzrostu izolatu klinicznego gronkowca złocistego i wzorcowego szczepu paciorkowca kałowego (Enlerococcus hirae) stwierdzono przy stężeniu preparatu 70%.

Oznaczenie aktywności bójczej potwierdziło skuteczność preparatu. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2. Oznaczenie wartości MBC pozwala na stwierdzenie, że bójcze działanie ma preparat w stężeniu 80% w stosunku do klinicznego szczepu Staphylococcus aureus oraz w stężeniu 75% dla klinicznego wysoce opornego Klebsiella oxytoca. W stosunku do Pseudomonas aeruginosa aktywność bójcza uzyskiwana jest już przy stężeniu 70%, zaś wszystkie komórki Candida albicans są zabijane już działaniem stężenia 45%. Dla trzech szczepów wzorcowych - gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus ATCC 6538), paciorkowca kałowego (Enterococcus hirac. ATCC 10541) i pałeczki okrężnicy (Escherichia coli ATCC 10538) oraz jednego izolatu klinicznego Escherichia coli wartość MBC wynosi powyżej 80%. Jednakże, obliczenie odsetka komórek przeżywających w obecności 80% preparatu pozwala stwierdzić, że spośród nich liczba komórek trzech szczepów ulegała znaczncmu ograniczeniu. W tych warunkach przeżywało 1,2% populacji Staphylococcus aureus oraz 0,43% i 0,14% komórek Escherichia coli

Wróć do początku

Komentarz i wnioski

"Witch Hazel" jest złożonym preparatem parafarmaceutycznym zawierajacym składniki naturalne. W piśmiennictwie, także najnowszym, pojawiają się liczne doniesienia o korzystnym działaniu wyciągu z oczara przy jego zastosowaniu klinicznym. Obok licznych wcześniejszych donieseń wskazujących na jego działanie sciągające, przeciwkrwotoczne i przeciwzapalne i przyśpieszające ziarninowanie spotyka się nowe informacje o jego działaniu usuwającym rodniki nadtlenku azotu (ONOO-), działaniu ochronnym przed promieniami UV, czy też jego skuteczności w zapobieganiu atrofii dróg moczopłciowych w menopauzie [1,3,5]. Działanie antyseptyczne wykazywano przy zastosowaniu wysokich stężeń destylatu (90%) [2].

Przeprowadzona ocena dotyczyła pełnego preparatu, w którym obserwowane działanie przeciwbakteryjne jest wypadkową działania wyciągu z kory oczara wirginijskiego (Hamamelis virginiana) i niskiego stężenia alkoholu. Otrzymane wyniki w pełni potwierdzają dane o działaniu antyseptycznym preparatu. Wykazał on skuteczność zarówno w stosunku do wrażliwych szczepów wzorcowych, ale także wyjatkowo opornych szczepów klinicznych. Szczególnie korzystne, niszczące drobnoustroje działanie wykazano w stosunku do bakterii Gram-ujemnych i grzybow. Preparat nie tylko hamuje rozwój bakterii, ale w wielu przypadkach zabija je. Są udokumentowane podstawy, aby sądzić, że jego zastosowanie jako preparatu pomocniczego w wielu przypadkach może mieć znakomite działanie. Można się też spodziewać, że działanie przeciwbakteryjne będą miały także inne parafarmaceutyki zawierające wyciąg z oczara jak np. nasączone 50% jego roztworem płatki (chusteczki) -Hygienic Cleaning Pads" (Clay-Park Labs, Inc.Bronx, NY 10457).

Wróć do początku

Wyniki badań bezpieczeństwa stosowania Destylowanego Ekstraktu z "Oczaru Wirginijskiego"

Przeprowadzono badania z zakresie dwóch niezwykle istotnych dla preparatów tego typu parametrów.

1. Ocena Bezpieczeństwa Klinicznego - badanie potencjalnej zdolności do wywoływania podrażnień i uczuleń na skórze człowieka przy wielokrotnym zastosowaniu. Badania przeprowadzono w klinice badań testowych Essex Testing Clinic, 799 Bloomfield Avenue, Yerona, New York 07044, USA. Obiektem badań było 106 ochotników, 17 mężczyzn i 89 kobiet w wieku od 18 do 65 lat. Badanie przeprowadzono metodą 9 -krotnego Skórnego Testu Wielokrotnego Narażenia.

W wyniku badań ustalono ponad wszelką wątpliwość, że destylat z „Oczaru Wirginijskiego" nie przejawia żadnych niekorzystnych własności fizycznych oraz, że nie występują żadne przeciwwskazania dermatologiczne, które mogłyby ograniczyć możliwość jego powszechnego stosowania na skórę człowieka.

2. Ocena działania mutagennego i toksycznego preparatu. Badania przeprowadzono w Toxicon Corporation, 225 Wildwood Avenue, Woburn, A 01801. USA. Obiektem badań były mutanty bakterii Salmonella lyphiimirium, szczególnie wrażliwe na toksyczne i/lub mutagenne działanie naturalnych i syntetycznych związków chemicznych. Użyto testu Ames'a z wykorzystaniem czterech szczepów testowych w dwóch typach badań uwzględniających działanie bezpośrednie preparatu oraz działanie jego metabolitów uzyskiwanych w wyniku działania frakcji mikrosomalnej wątroby ssaka.

W wyniku badań ustalono, że destylat z „Oczaru Wirginijskiego" nie ma działania toksycznego ani mutagennego, a co za tym idzie nie posiada działania rakotwórczego. Nie stanowi tym samym zagrożenia dla człowieka nawet w czasie długotrwałego stosowania.

Wróć do początku

Piśmiennictwo

1. Choi H.R , Chio J.S, Han Y.N, Bae S.J., Chung H.Y., Peroxynitrite scavenging activity of herb extracts. Phytoder. Res. 2002, 16:364-3672. Gloor M., Reichling J., Wasik B Holzgang H.E. Antiseptic effect of topical dermatological formulation that contains Hamemelis distillate and urea.3. Hughes-Formella B.J., Flibry A., Gassmuller J., Rippke F.Anti-inflammatory efficacy of topicalpreparation with 10% hamamelis distillate in a UV erythema test.4. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically. 4th ed. Approved Standard, NCCLS Document M7-A4. 19975. Willhite L.A., O'Connell M.B. Urogenical atrophy: prevetion and treatment Pharmacotherapy. 2001, 21:464-480

Wróć do początku